Méthode Castellani : conserver durablement une souche fongique à l’eau stérile

La méthode Castellani est une technique de conservation des souches fongiques dans de l’eau stérile, utilisée depuis longtemps en microbiologie et en mycologie appliquée. En myciculture, elle intéresse surtout les cultivateurs qui veulent stabiliser une souche propre pendant plusieurs mois à plusieurs années, sans repiquages fréquents sur gélose. Bien exécutée, elle limite le vieillissement des cultures, réduit la consommation de consommables et diminue le risque de dérive ou de contamination lié aux transferts répétés.

Chez TerraFungi, nous la considérons comme une méthode de stockage, pas comme une technique de multiplication. Elle complète très bien le travail sur gélose, culture liquide et spawn, mais ne les remplace pas.

À quoi sert exactement la méthode Castellani ?

Le principe est simple : on place de petits fragments de mycélium colonisé dans un flacon ou un tube contenant de l’eau stérile, puis on conserve l’ensemble à température fraîche et stable. L’objectif est de ralentir fortement l’activité métabolique du champignon sans le tuer.

Concrètement, la méthode Castellani est utile pour :

• conserver une souche entre deux cycles de production ;
• garder un backup propre d’un isolat intéressant ;
• éviter des repiquages trop fréquents sur boîte de Pétri ;
• réduire le risque de sénescence lié aux subcultures successives ;
• archiver plusieurs souches dans un espace réduit.

Elle est particulièrement pertinente pour les cultivateurs qui travaillent déjà sur gélose. Si vous débutez totalement, commencez plutôt par comprendre les bases de l’inoculation et des supports de culture, par exemple avec notre article sur la culture liquide ou spores.

La méthode Castellani ne “booste” pas un mycélium : elle sert à le conserver dans un état de faible activité, afin de pouvoir le relancer plus tard sur milieu nutritif.

Matériel, conditions et protocole pratique

Pour une version fiable en laboratoire artisanal, prévoyez :

• tubes ou fioles stériles à bouchon étanche ;
• eau stérile ou eau distillée stérilisée ;
• fragments de gélose colonisée par une culture saine et vigoureuse ;
• scalpel ou emporte-pièce stérile ;
• parafilm ou fermeture sécurisée ;
• zone de travail propre : idéalement hotte à flux laminaire ou boîte à gants propre.

L’usage du parafilm peut sécuriser les fermetures ; voir aussi notre guide sur l’utilisation du parafilm.

Protocole étape par étape

1. Préparer l’eau stérile
   Remplir chaque tube avec 3 à 10 mL d’eau stérile. Stériliser si nécessaire à 121 °C pendant 15 à 20 minutes.

2. Choisir une culture jeune
   Prélever sur une boîte de Pétri propre, idéalement une culture de 7 à 14 jours, sans secteur suspect, sans métabolites excessifs, sans contamination visible.

3. Découper de petits fragments
   Prélever 3 à 8 morceaux de gélose colonisée de 2 à 5 mm de côté. Des fragments trop gros redémarrent parfois moins régulièrement et occupent inutilement le volume.

4. Immerger dans l’eau stérile
   Déposer les fragments dans le tube sans éclaboussure ni contact non stérile. Les morceaux doivent être totalement immergés.

5. Fermer et étiqueter
   Noter : espèce, souche, date, milieu d’origine, numéro de lot. C’est indispensable si vous gérez plusieurs lignées.

6. Stocker au frais
   Conserver à 4 à 15 °C. En pratique, 4 à 8 °C offre généralement la meilleure stabilité pour un stockage long. Évitez les variations thermiques répétées.

Durée de conservation, espèces adaptées et limites réelles

La longévité dépend fortement de l’espèce, de la propreté initiale et de la qualité du protocole. Pour beaucoup de basidiomycètes cultivés, une fenêtre réaliste est de 6 à 24 mois avec un bon taux de reprise. Certaines souches tiennent plus longtemps, mais il faut rester prudent : au-delà, la viabilité devient plus variable.

Repères pratiques

| Paramètre | Valeur recommandée | |---|---:| | Température de stockage | 4 à 8 °C | | Volume d’eau stérile | 3 à 10 mL | | Taille des fragments | 2 à 5 mm | | Âge de la culture source | 7 à 14 jours | | Première vérification de viabilité | 6 à 12 mois |

Espèces souvent compatibles en conservation courte à moyenne durée :

• Pleurotus ostreatus et autres pleurotes ;
• Agrocybe aegerita ;
• Hericium erinaceus ;
• plusieurs espèces lignicoles courantes de culture.

En revanche, toutes les souches ne réagissent pas pareil. Certaines récupèrent vite en 3 à 7 jours sur gélose, d’autres demandent 1 à 3 semaines avant une reprise visible. Pour les espèces plus exigeantes, il est judicieux de conserver aussi une copie active sur gélose repiquée à intervalle maîtrisé.

Comment relancer une souche conservée par méthode Castellani

La remise en culture doit se faire comme un repiquage classique, en environnement propre.

Étapes de relance

• sortir le tube du froid et laisser revenir 10 à 20 minutes à température ambiante ;
• prélever un fragment immergé avec un outil stérile ;
• déposer sur une gélose nutritive propre ;
• incuber selon l’espèce, souvent entre 22 et 25 °C pour les espèces lignicoles courantes ;
• observer la reprise pendant 7 à 14 jours.

Si le fragment tarde à repartir, ne concluez pas trop vite à un échec avant 2 à 3 semaines. Certaines souches ont un redémarrage lent après stockage.

Une fois la croissance redevenue franche sur gélose, vous pourrez préparer un inoculum adapté à votre objectif : grain, culture liquide ou substrat. Pour bien choisir le support suivant, consultez notre article sur le substrat champignon ou celui sur le grain millet.

Erreurs fréquentes avec la méthode Castellani

La plupart des échecs viennent moins de la méthode elle-même que de la qualité du matériel de départ.

À éviter absolument

• conserver une culture déjà douteuse : la méthode ne “nettoie” pas une souche ;
• utiliser une eau non stérile ou un tube mal fermé ;
• stocker à température ambiante pendant des mois ;
• oublier l’étiquetage précis ;
• multiplier les ouvertures du même tube ;
• attendre trop longtemps avant de tester la viabilité.

Si votre culture montre des signes suspects, isolez d’abord le problème. En cas de sporulation verte ou de croissance concurrente, lisez notre guide sur Trichoderma. Et si vous hésitez sur les notions d’asepsie thermique, notre article sur stérilisation et pasteurisation pose les bases utiles.

Conclusion

La méthode Castellani est l’une des solutions les plus simples pour conserver une souche fongique propre sans entretien constant. Son vrai intérêt en myciculture est clair : moins de repiquages, moins de dérive, moins de consommables, à condition de partir d’une culture saine et de respecter une asepsie stricte. Pour un laboratoire amateur sérieux ou un petit atelier de production, c’est une excellente méthode de sauvegarde intermédiaire.

Si vous souhaitez monter un protocole de conservation propre et reproductible, retrouvez sur le catalogue TerraFungi nos boîtes de Pétri, milieux, parafilm, consommables stériles et matériel de laboratoire pour sécuriser chaque étape de votre travail mycologique.